兔原代細(xì)胞是直接從兔組織那兒分離出來的，進(jìn)而把原代特性給保留住了，它可是在體外去研究兔生理以及病理機(jī)制時(shí)相當(dāng)重要的模型。要成功對(duì)兔原代細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)的話，得留意無菌操作、酶消化時(shí)間、培養(yǎng)條件等好些個(gè)環(huán)節(jié)。把這些關(guān)鍵步驟掌握好，能夠大幅提升細(xì)胞活性與純度，給后續(xù)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
兔原代細(xì)胞分離方法
把兔原代細(xì)胞進(jìn)行分離之際，組織的獲取以及預(yù)處理乃是關(guān)鍵的頭一步。從做實(shí)驗(yàn)的兔子那兒得到目標(biāo)器官后，快速轉(zhuǎn)移到含有雙抗的PBS里漂洗三次，把筋膜與血管給剔除掉。接著把組織切成一立方毫米的碎塊，加入兩到三倍體積的百分之零點(diǎn)二五的胰蛋白酶-EDTA消化液，在三十七攝氏度的搖床里消化大概三十分鐘，每隔十分鐘去觀察一下消化的程度。
待消化完畢后，添加等體積含有血清的培養(yǎng)基來終止反應(yīng)，輕輕地進(jìn)行吹打以使細(xì)胞分散開來。經(jīng)由200目尼龍網(wǎng)進(jìn)行過濾從而去除殘留的組織塊，濾液以每分鐘800轉(zhuǎn)的速度離心5至8分鐘，然后舍棄上清液。沉淀用紅細(xì)胞裂解液重懸2分鐘（若血液污染較為嚴(yán)重的情況下），再次離心之后獲得細(xì)胞團(tuán)塊。把細(xì)胞重新懸浮于完全培養(yǎng)基之中，用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色以計(jì)數(shù)活力，活力應(yīng)當(dāng)大于90%才能夠繼續(xù)培養(yǎng)。
兔原代細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化
對(duì)于兔的原代細(xì)胞而言，其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境敏感性較高，故而推薦使用專用培養(yǎng)基，像DMEM/F12這般的，或者是RPMI - 1640，里面要添加10%至20%的胎牛血清以及1%的非必需氨基酸。與此同時(shí)，還要補(bǔ)充堿性成纖維生長(zhǎng)因子以及表皮生長(zhǎng)因子，每毫升添加量為5至10納克，如此能夠促進(jìn)貼壁以及增殖。培養(yǎng)箱的條件設(shè)定為37℃、5%二氧化碳，相對(duì)濕度要保持飽和狀態(tài)。
兔原代細(xì)胞生長(zhǎng)受接種密度影響顯著，建議初始密度為每平方厘米1×10^5個(gè)細(xì)胞接種，接種完成后48小時(shí)內(nèi)要避免移動(dòng)培養(yǎng)皿并保持靜置不得變動(dòng)，每過2至3天實(shí)施半量換液操作，換液時(shí)要注意觀察培養(yǎng)基顏色，一旦變黃就需及時(shí)更換，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右的時(shí)候就要進(jìn)行傳代，傳代比例為1:2至1:3，使用胰蛋白酶消化時(shí)時(shí)間不要超過2分鐘以防過度損傷，還可添加青霉素 - 鏈霉素雙抗用于預(yù)防污染。
兔原代細(xì)胞鑒定與純度分析
鑒別兔原代細(xì)胞的身份以及純度乃確保研究結(jié)果具備可靠性的前提情況。一般常用的方法涉及形態(tài)學(xué)的觀測(cè)，在倒置顯微鏡之下，兔的上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出鋪路石一樣的狀態(tài)，而成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形的樣子。與此同時(shí)能夠開展免疫細(xì)胞化學(xué)的染色操作，針對(duì)像是細(xì)胞角蛋白這種細(xì)胞特異性標(biāo)志物（上皮來源存在的）或者波形蛋白（間質(zhì)來源有的），去計(jì)算陽性細(xì)胞所占的比例。
對(duì)于細(xì)胞而言，流式細(xì)胞術(shù)可更精準(zhǔn)地去量化其純度，需先把細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接著讓其與熒光標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，之后再上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，就像兔腎小管上皮細(xì)胞能用水通道蛋白1和E -鈣黏蛋白進(jìn)行雙標(biāo)，并且要求其純度大于95%，除此之外，PCR檢測(cè)外源因子比如支原體也是常規(guī)的質(zhì)控環(huán)節(jié)，只有經(jīng)過鑒定合格的細(xì)胞才能夠用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，以此來避免因交叉污染或者老化從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差。
倘若掌握那上述所提及的分離、培養(yǎng)以及鑒定的核心技術(shù)，便能夠穩(wěn)定地獲取高質(zhì)量的兔原代細(xì)胞，進(jìn)而為各類基礎(chǔ)研究提供有力的工具。
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