在科研這條道路上奮力拼搏，我的老同學王明那可是歷經艱辛才有所成就的。他于某大學的生物學院身為青年研究員，手中常年緊握著兩三個關于腫瘤早篩標記物的課題，內心懷揣著在表觀遺傳學領域鉆研出具有臨床應用前景成果的夢想。那些熟知他的人都清楚，他實驗室的燈呀，一般是樓里最后一個滅掉的。
但就在最近的半年之內，王明仿佛是被施加了禁錮咒一般，整個人都呈現出萎靡不振的狀態(tài)。他所負責牽頭的一項重點課題，在一個極為關鍵的環(huán)節(jié)上遭遇了阻礙——該環(huán)節(jié)是對DNA啟動子區(qū)域特定的CpG位點的甲基化水平進行精確的定量分析。而這件事情直接關聯到他手中所掌握的那個潛在標記物最終是否能夠得到驗證。按照他自己所言：“倘若數據不穩(wěn)定，內心就會缺乏底氣，論文無法發(fā)表出去，那么明年的考評也將會面臨危機?！?。
他所使用的，乃是一款在市面上較為常見的普通熒光定量PCR試劑盒，并且搭配了由自己設計的甲基化特異性引物。那么結果究竟如何呢？其重復性之差，簡直能讓人抓狂。對于同一樣本，在今天進行檢測時跑出來的甲基化水平為30%，而過了兩天再次進行測量時，卻變成了45%。組里的學生在私下里紛紛暗自嘀咕，這樣的數據，究竟誰敢去使用呢？更為讓人頭疼不已的是，在對低甲基化水平樣本進行檢測之時，信號微弱得幾乎已然和背景噪音混合在了一起，根本就無法分清彼此究竟誰是誰。在那一陣子當中，組會的氣氛始終都是格外凝重的，王明眉頭上的“川”字紋，從來就沒有舒展過。
甲基化特異性PCR試劑盒哪個品牌好？
王明察覺到，問題或許出在工具這兒。他并非沒想去更換，然而市面上的甲基化特異性PCR也就是MSP，還有其定量版本的產品，各種各樣，有國產的、有進口的，宣稱具備高靈敏性的、寬動態(tài)范圍的，讓人看得目不暇接。有一回，他看中一款進口品牌，價格高昂，咬著牙把它買回來嘗試，靈敏度是提升上去了，可對于復雜基因背景的耐受性好像又不太能達到理想狀態(tài)，碰到GC含量高的區(qū)域，擴增效率下降得十分顯著。
“可不能僅僅只看廣告，還得著重去看療效。”王明著手開始發(fā)動起所有的關系，在朋友圈里、學術群當中打聽。去年十月底時，在上海參與一個表觀遺傳學小型研討會之際，茶歇的那段期間內，他跟一位在知名檢驗機構工作的師姐交談起來了這個困擾。師姐聽完之后，并沒有直接去推薦品牌，反而是問了他幾個非常具體的問題：“你主要所針對的是哪一種類型的樣本？是組織、細胞還是源自液體活檢的DNA？你所期待的檢測下限是多少？預算大概處于什么樣的范圍？”。
這一個問題，將王明給問得清醒過來了。他發(fā)覺自身先前在進行選型的時候太過盲目，僅僅只是一味地去追求“最好”的情況，然而卻著實沒有想明白“最合適”究竟是怎么一回事兒。他所擁有的樣本之中，有很多都是歷經亞硫酸鹽處理的FFPE（也就是福爾馬林固定石蠟包埋）組織DNA，其本身就有著一定程度上的降解現象，并且起始量也是十分有限的。他所需要用到的試劑盒呢，必然是要針對這類特別“難纏”的模板擁有十分出眾的擴增能力，同時還要能夠有效地去區(qū)分經過亞硫酸鹽處理之后序列差異極其微小的甲基化與非甲基化DNA，防止因為非特異性擴增而產生出假陽性情況。
甲基化特異性PCR檢測靈敏度如何保證？
鑒于這些清晰明確的需求，王明再度開啟了篩選工作。他不再單純憑借品牌光環(huán)來考量，而是認真細致地去研讀各類不同產品的技術白皮書，著重聚焦于幾個關鍵核心參數：即針對亞硫酸鹽轉化之后DNA的擴增效率，特異性（特別是針對非甲基化DNA的排解能力），還有在起始模板量比較低的狀況下的檢測穩(wěn)定性。
他經由查閱諸多文獻以及產品評測發(fā)覺，一款出色的甲基化特異性定量PCR試劑盒，其奧妙常常隱匿于熱啟動酶的活性之中，以及針對亞硫酸鹽處理DNA優(yōu)化而成的緩沖體系里面。有的試劑借助添加特殊的增強劑來開啟DNA intricate二級結構，使聚合酶更輕易“啃”動高GC區(qū)域；有的則在引物設計軟件以及探針化學修飾方面投入精力，保證信號特異且強勁。
對多個品牌進行一番對比，還申請了多個品牌的小樣來開展平行測試，之后王明最終鎖定了一款國產品牌的甲基化特異性PCR定量檢測試劑盒?！皩嵲捳f，在決定使用它之前我心里也是忐忑不安的，”他后來跟我講述道，“不過是以實測數據作為依據的。”他運用課題里已知甲基化狀態(tài)的陽性對照以及陰性對照樣本，持續(xù)做了五輪重復實驗。
如何評估甲基化特異性PCR試劑盒的重復性？
結論能夠讓人感到極為情緒上的高漲。于檢測界限低到僅僅只有10個拷貝的甲基化模板的狀況下的情形里，那個試劑盒依舊能夠給出穩(wěn)定并且能夠進行區(qū)分辨別開來的Ct值，批次內部以及批次之間的變異系數也就是CV值全部都被限定控制在了5%以內那樣子，此呈現遠遠超越了他之前所使用過的產品的表現情況。這會意味表明著這樣的一種成果，哪怕是樣本之中極其細小微量的甲基化信號，同樣能夠被穩(wěn)定地捕獲捕捉起來，這極大程度上提高提升了檢測的精確準確程度以及對于早期微量病變的發(fā)現察覺能力。去年12月的某一個周三的下午時分，當他拿到這一組重復性堪稱完美的電泳圖以及擴增曲線的時候，實驗室里邊十分難得地響起了一聲令人感到輕松爽快的歡呼之聲。
核心工具問題得以解決，王明課題的推進速度顯著加快，穩(wěn)定的數據成為他論證假說的堅實基礎，他無需再為數據的變幻不定而憂慮，能夠把更多精力投放至實驗設計與結果分析中，更為關鍵的是，可靠的檢測結果使他對下游的生物信息學分析以及臨床關聯研究擁有了更強的信心。
他對著我們幾個老朋友發(fā)出感慨，說道，“做事情要想做好，必須先使工具精良，這話在咱們這個行業(yè)實在是太貼切了”，看起來僅僅是更換了一個試劑盒，實際上卻是找到了一套能夠解決問題的可靠辦法，它使得不可控的因素數量減少了，讓你的努力更能夠確定無疑地轉化為成果，如今，他所在的課題組已然習慣使用那套經過驗證的試劑體系，并且開始在新的研究方向當中拓展其應用。
那段屬于王明的經歷，說不定能夠給好些正于類似艱難處境里探尋的科研同行一些啟示。在表觀遺傳學的研究當中，特別是在DNA甲基化檢測這條頗為精細的路徑上，挑選一款跟你的樣本特質、檢測目的精確適配的甲基化特異性PCR試劑盒，可不是一件簡單之事啊。它會對數據生成的質量、實驗的可重復性，甚至是整個研究項目的成敗產生直接影響。鎖定關鍵需求后，深入去理解技術細節(jié)詳情，并采用嚴謹的比較測試來取代盲目選擇，也許這就是我們去應對挑戰(zhàn)、促使科研之路走得更為平穩(wěn)妥當的關鍵一步呢。
