身為一名在分子生物學(xué)領(lǐng)域深入鉆研差不多近十年的科研工作者，我始終覺著，實(shí)驗(yàn)室里那張用于工作的桌子，就是留存我人生記憶切片的保存儀器。其上不但存在瞬間即逝的靈感，更多的是一天天重復(fù)進(jìn)行的操作以及偶爾令人著急的意外情況。在這當(dāng)中，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，便是我記憶里最為醒目的一部分。它好似一把鎖，既將無數(shù)個深夜里的拼搏給鎖住了，又把黎明前那片灰蒙蒙的天空鎖住了。而今天我打算講述的，并非高深的理論，而是我的一位摯友——老陳，他最近在PCR實(shí)驗(yàn)方面的一段真實(shí)經(jīng)歷?；蛟S，在這個故事當(dāng)中，正存在著你所正在經(jīng)歷的那種困惑，還有一個出乎你意料的解決方案。
我在華東某地的高校生命科學(xué)學(xué)院讀博時，室友是老陳，現(xiàn)在他在南方一家有名的生物科技公司當(dāng)研發(fā)主管。他的工作，簡單來講，就是帶著團(tuán)隊(duì)，針對公司的核心產(chǎn)品，也就是一款用于病原體快速檢測的試劑盒，不斷去優(yōu)化它核心的PCR檢測模塊。這工作一聽好似厲害得很，實(shí)際上壓力賊大，既要確保檢測的靈敏度跟特異性，又得控制成本，更麻煩的是，研發(fā)周期被市場部壓得都快沒氣兒。
PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)為什么總是不穩(wěn)定？
去年秋天起始，老陳陷入了困境。公司打算推出一款升級版檢測試劑盒，要求把原有的多重PCR體系從檢測3種靶標(biāo)擴(kuò)充到5種。這如同一個精準(zhǔn)的化學(xué)樂隊(duì)，要在同一個反應(yīng)管內(nèi)，讓五位樂手（引物對）各自完美演奏，且不能相互干擾。用老陳的話描述，老陳團(tuán)隊(duì)初期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，“就像三月的天氣，娃娃的臉——說變就變”。擴(kuò)增曲線忽高忽低，有的靶標(biāo)信號強(qiáng)，有的卻弱得幾乎看不見，重復(fù)性更是差得離譜。
那段時期，我實(shí)驗(yàn)室之中的燈，基本上是整座樓里最后熄滅的那一盞。老陳于電話里頭向我一番吐槽，表示我跟團(tuán)隊(duì)把所有存有可能性的緣由都逐一排查遍了：關(guān)于模板質(zhì)量方面，核酸提取的步驟我們已然是遵循標(biāo)準(zhǔn)流程操作的；說到引物設(shè)計(jì)，生物信息學(xué)的同事進(jìn)行過反復(fù)驗(yàn)證，從理論層面來講是不存在問題的；那退火溫度呢，我們開展了梯度PCR，然而依舊尋覓不到一個能夠讓所有靶標(biāo)全都呈現(xiàn)出穩(wěn)定狀態(tài)的所謂“甜蜜點(diǎn)”。問題好像就這般僵持在了一個膠著的狀況之中。他們察覺到，具體問題會出在PCR反應(yīng)體系自身，就是那個處于最基礎(chǔ)狀態(tài)，然而卻極易被忽視掉的“黑箱”，也就是PCR Mix，也就是預(yù)混的擴(kuò)增試劑。
如何選擇適合復(fù)雜模板的PCR擴(kuò)增試劑盒？
平常傳統(tǒng)的那種做法，是去購買在市面上能夠通用的PCR預(yù)混液，購買之后然后自己朝著里面添加引物、模板以及水?？墒悄剡@種通用型的產(chǎn)品，在面對像老陳這種具有高難度的多重PCR情況時，特別是模板的背景比較復(fù)雜化（就好比直接從臨床樣本或是環(huán)境樣本當(dāng)中提取出來的粗提核酸那樣），往往常常會顯得力不從心。通用Mix里面的酶有可能會對某些抑制劑較為敏感，緩沖體系也有可能并不適合所有引物對去協(xié)同工作。老陳所需要的是一個更加“聰明”、兼容性更強(qiáng)的解決方案。
原本目光未投射向那些專為“困難模板”去設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)試劑盒的他，開始有了這樣的舉動。這類產(chǎn)品的宣傳要點(diǎn)常常是在于其具備“強(qiáng)大的抗抑制能力”以及“寬廣的引物兼容性”。老陳在圍繞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行一番搜羅后，把幾個主流品牌的產(chǎn)品技術(shù)手冊給下載下來，而后一頁一頁地去認(rèn)真研讀。他發(fā)覺，這些專業(yè)試劑盒的核心“黑科技”平常聚焦于幾個要點(diǎn)：其一，運(yùn)用經(jīng)過基因工程改造的、具備更強(qiáng)耐受性的熱啟動DNA聚合酶，可切實(shí)防止低溫狀況下的非特異性擴(kuò)增；其二，優(yōu)化了緩沖體系，或許含有像BSA、甜菜堿等輔料，用以穩(wěn)固酶活、削減二級結(jié)構(gòu)干擾并中和常見的PCR抑制劑；其三，給出了更具靈活性的配方，時而為預(yù)混dNTPs和Mg2+的2× Master Mix，時而又把各組分分開，準(zhǔn)許用戶依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求精準(zhǔn)調(diào)控Mg2+濃度。
“仿佛瞅著參數(shù)彼此相近，皆宣稱自身具備良好兼容性以及較高穩(wěn)定性?！崩详愔v道，“然而這東西恰似買鞋子那般，參數(shù)乃是標(biāo)稱的情況，究竟適不適合，唯有親自嘗試過后才能夠確切知曉?！彼露Q心不再僅停留于理論探討，而是去申請了一筆預(yù)算，挑選出三款針對復(fù)雜模板擴(kuò)增而言口碑效果較好的PCR試劑盒，打算開展一場實(shí)實(shí)在在的“暗中測試”。
PCR試劑盒的預(yù)混液和自配體系有什么區(qū)別？
在今年三月初的時候，測試的地點(diǎn)處于他們公司的研發(fā)實(shí)驗(yàn)室。存在一個這樣子精心設(shè)計(jì)的嚴(yán)謹(jǐn)對比實(shí)驗(yàn)，是由老陳完成的：采用上用同一批含有復(fù)雜背景的模板，這個復(fù)雜背景模擬了像血紅素、肝素等常見抑制物，再通過三款候選試劑盒，分別設(shè)為A、B、C，以及他們此前使用的自配體系來進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。自配體系是他們運(yùn)用高保真酶、dNTP、緩沖液等自行加以調(diào)配的，于理論層面而言能夠依據(jù)需要進(jìn)行微調(diào)，然而每次配制的時候都會出現(xiàn)批間差，并且操作顯得很是繁瑣。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對比呈現(xiàn)出鮮明態(tài)勢，自配體系產(chǎn)生的結(jié)果有著仍不穩(wěn)定的狀況，五個靶標(biāo)當(dāng)中總會存在一兩個出現(xiàn)“掉隊(duì)”，試劑盒A的表現(xiàn)處于中規(guī)中矩狀態(tài)，然而有一個靶標(biāo)的擴(kuò)增效率顯著偏低，試劑盒B于抗抑制方面展現(xiàn)出突出表現(xiàn)，所有靶標(biāo)均存在信號，可是擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性好像有所問題，電泳條帶出現(xiàn)有點(diǎn)拖尾情形，至于試劑盒C，按照老陳以略帶興奮的口吻所說，“給出了近乎教科書般的擴(kuò)增曲線以及電泳圖”，五個靶標(biāo)的Ct值呈現(xiàn)集中且穩(wěn)定的情況，熔解曲線呈現(xiàn)單一尖銳狀態(tài)，電泳條帶清晰且明亮，不存在引物二聚體。
“那一刻我領(lǐng)悟到了，”老陳發(fā)出感慨，“涉及專業(yè)領(lǐng)域的事務(wù)，確實(shí)應(yīng)當(dāng)交付給專業(yè)的‘器具’。我們自行配置體系一事，猶如自行購置組件去組裝電腦，能力出眾者大概能打造出堪稱神機(jī)的成果，但既耗費(fèi)時間又投入精力，而且穩(wěn)定性方面存在疑慮。然而有一款出色的預(yù)混式PCR試劑盒，恰似一臺品牌化的整機(jī)，在出廠之前經(jīng)歷了嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的適配和檢測，你將其拿過來，添加進(jìn)模板以及引物，按下‘開機(jī)按鈕’（放置到機(jī)器上運(yùn)行），它便能夠賦予你穩(wěn)定且可靠的輸出結(jié)果。特別是在面臨復(fù)雜的模板以及高通量篩查的狀況下，這種‘拿來就能用’的穩(wěn)定性以及便捷性，所具備的價值極大?！薄?/p>
高保真PCR擴(kuò)增試劑盒在研發(fā)中有什么優(yōu)勢？
最終，老陳團(tuán)隊(duì)選定了試劑盒C，用于后續(xù)的深度開發(fā)以及驗(yàn)證。這款產(chǎn)品存在一個額外亮點(diǎn)，即它集成了高保真DNA聚合酶。這對于老陳他們的研發(fā)工作而言至關(guān)重要，鑒于他們的檢測試劑盒后續(xù)有可能涉及對擴(kuò)增產(chǎn)物開展測序分析，目的在于確認(rèn)突變位點(diǎn)或者進(jìn)行分型。由于高保真酶具備極低的錯配率，因而保證了序列信息的準(zhǔn)確性，為下游應(yīng)用清除了障礙。
以往，我們要是為了保真度，或許就得去犧牲掉一些擴(kuò)增效率或者速度。如今，這個試劑盒把兩者結(jié)合得相當(dāng)不錯，它保真度高，而且擴(kuò)增速度也快，一個循環(huán)能夠省下十幾秒，整套PCR流程進(jìn)行下來能夠節(jié)約不少時間。老陳介紹說。這節(jié)省下來的時間，對于爭分奪秒的研發(fā)周期以及后續(xù)有可能存在的生產(chǎn)環(huán)節(jié)而言，都意味著效率與成本方面的優(yōu)勢。
自那之后，老陳所在團(tuán)隊(duì)的研發(fā)進(jìn)程顯著加快，原本陷入停滯的多重PCR體系優(yōu)化工作，由于尋獲了穩(wěn)定且可靠的核心反應(yīng)組件，遂得以快速推進(jìn)，他們很快達(dá)成了新試劑盒原型的性能驗(yàn)證，所獲數(shù)據(jù)出色，重復(fù)性相當(dāng)棒，最近一次進(jìn)行通話時，老陳告知我，他們的升級版檢測試劑盒已然步入中試生產(chǎn)階段，市場反饋回來的前期測試結(jié)果極為樂觀。
回溯老陳那段閱歷，先是深陷重復(fù)性劣質(zhì)的困境里，接著主動去尋覓專業(yè)器具，隨后借助系統(tǒng)評估找出最優(yōu)解決辦法，最終達(dá)成研發(fā)瓶頸的跨越突破。這般歷程，鮮活地呈現(xiàn)出一則道理：于現(xiàn)代科研以及產(chǎn)品研制之中，挑選一款契合水準(zhǔn)卓異、穩(wěn)定可靠條件的“工具”，常常要比僅僅一味苦耗技術(shù)精微之處更能夠達(dá)成事半功倍之效果。對于每一位投身于PCR實(shí)驗(yàn)的科研工作者，特別是那些面臨復(fù)雜樣本，或是有著多重檢測需求，又或是有高保真要求的研發(fā)人員來講，花費(fèi)時間去知曉并挑選一款切實(shí)契合自身的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)試劑盒，也許就是開啟效率之門的那把關(guān)鍵鑰匙。它無法取代你精巧的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮鳎欢軌驗(yàn)槟憬o予一個堅(jiān)實(shí)、穩(wěn)固的基礎(chǔ)平臺，使得你的智慧與努力，能夠以最精確、最穩(wěn)定的方式展現(xiàn)出來。這，大概就是技術(shù)與工具之間，最美好的協(xié)同。
