去年夏天，于北京海淀區(qū)，有一家生物科技公司的實(shí)驗(yàn)室里，我目睹了朋友李工一段‘渡劫’歷程。李工身為這家公司細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)負(fù)責(zé)人，其每日所做工作是與種種不一樣的‘細(xì)胞株’接觸，致力于保證那些珍稀難得‘種子’康健、平穩(wěn)地實(shí)現(xiàn)增殖增長(zhǎng)，進(jìn)而為下游藥物篩選以及功能研究供應(yīng)接連不斷的材料。此份工作表面看似基礎(chǔ)簡(jiǎn)單，實(shí)則可稱作整個(gè)研發(fā)鏈關(guān)鍵之‘咽喉要道’處。因?yàn)榧?xì)胞呈現(xiàn)的狀態(tài)優(yōu)劣，是十分直接地決定了后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)所能獲取的數(shù)據(jù)可以信賴的程度。
然而，那些日子里，李工竟陷入了持續(xù)不斷的焦慮。他手頭所負(fù)責(zé)的，一個(gè)用于抗體表達(dá)的關(guān)鍵CHO細(xì)胞株，連續(xù)三代出現(xiàn)了生長(zhǎng)速度顯著減緩、活率降低的狀況。更麻煩的是，細(xì)胞形態(tài)也變得不那么“典型”了。這如同農(nóng)民精心挑選培育的高產(chǎn)種子，忽然開始退化，不但產(chǎn)量減少，就連品相都變了模樣。項(xiàng)目進(jìn)度因而陷入停滯，每周的組會(huì)都充斥著壓抑的氛圍。
細(xì)胞株為什么會(huì)狀態(tài)不穩(wěn)甚至退化？
首先，李工排查了最為基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)，這環(huán)節(jié)包括培養(yǎng)基、血清以及培養(yǎng)箱環(huán)境。所有的耗材皆來自同一批次，溫濕度還有二氧化碳濃度同樣都處于監(jiān)控范圍以內(nèi)，由此排除了這些常見的變量。如此一來，問題好像指向了細(xì)胞本身。他帶著疑問詢問，是不是在傳代過程當(dāng)中操作存在著細(xì)微差異，才導(dǎo)致了選擇壓力發(fā)生變化呢？隨后，他重新梳理了標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)員展開了再培訓(xùn)。情況稍有改善，然而細(xì)胞狀態(tài)依舊沒有恢復(fù)到理想的水平。在那段時(shí)間里，他基本上長(zhǎng)時(shí)間待在了實(shí)驗(yàn)室，半夜起來查看培養(yǎng)箱數(shù)據(jù)這種事是很平常的。
如何評(píng)估細(xì)胞株的長(zhǎng)期穩(wěn)定性？
像活率、倍增時(shí)間這類常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)，僅能反映短期狀態(tài)，李工察覺到，或許得從更具本質(zhì)特性的層面去審視問題，他想到了“細(xì)胞株穩(wěn)定性”這個(gè)概念，這并非單純代指短期生長(zhǎng)狀況，而更與它在長(zhǎng)期傳代里遺傳背景、功能特性的一致性相關(guān)，尤其針對(duì)經(jīng)過基因工程改造、用以表達(dá)特定蛋白的工程化細(xì)胞株而言，其目的基因的整合位點(diǎn)、拷貝數(shù)以及表達(dá)水平的穩(wěn)定性，才是決定其能不能夠勝任工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵所在，李工于是開始查閱文獻(xiàn)，把目光投向了具有更深層次特性的鑒定和監(jiān)控手段。
細(xì)胞株開發(fā)過程中有哪些常見陷阱？
在深入展開排查工作期間，李工對(duì)這個(gè)細(xì)胞株的過往情況進(jìn)行了回顧。此細(xì)胞株乃是借助單克隆篩選得以獲取的，然而在最開始的篩選階段，對(duì)于不同單克隆的長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定性以及其生長(zhǎng)特性，究竟有沒有進(jìn)行充分的評(píng)估呢？所選中的這個(gè)克隆，本身在遺傳方面有沒有可能存在不穩(wěn)定的潛在風(fēng)險(xiǎn)呢這是細(xì)胞株開發(fā)進(jìn)程里比較常見的一類問題在一開始過于著重追逐初始階段的高表達(dá)量，卻忽略了克隆的穩(wěn)健程度此外在后續(xù)的擴(kuò)增保種環(huán)節(jié)會(huì)不會(huì)遵循“主細(xì)胞庫(kù)–工作細(xì)胞庫(kù)”的規(guī)范體系呢？要是在早期的時(shí)候，種子細(xì)胞的數(shù)量少了，或者保存的方式不合適，那么就有可能給隨后的波動(dòng)，埋下潛在的伏筆。
如何建立規(guī)范的細(xì)胞株保存與復(fù)蘇流程？
鑒于這些思索，李工決定采取兩手抓的方式。其一，他針對(duì)現(xiàn)有的問題細(xì)胞株展開了全方位的“檢查”，涵蓋核型分析、目的基因拷貝數(shù)測(cè)定以及表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定，以此探尋或許存在的遺傳漂流或表達(dá)偏差。其二，他著手去徹底重構(gòu)該細(xì)胞株的工作流程。他自更早代次、凍存狀況更佳的原始庫(kù)存里復(fù)蘇了細(xì)胞，并且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)匾?guī)劃了擴(kuò)增路線：規(guī)定最高傳代次數(shù)，在擴(kuò)增至足夠數(shù)量后，馬上進(jìn)行分裝凍存，構(gòu)建全新的、標(biāo)識(shí)明確的工作細(xì)胞庫(kù)，且預(yù)留足夠的備份。每一個(gè)凍存管都詳細(xì)記錄了細(xì)胞的代次、凍存日期和培養(yǎng)基信息。
細(xì)胞培養(yǎng)的日常監(jiān)控該注意哪些細(xì)節(jié)？
新的培養(yǎng)周期起始之后，李工強(qiáng)化了日常監(jiān)控的維度，且除了每日的顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)之外，他還引入部分定期檢測(cè)，即檢測(cè)培養(yǎng)基里的代謝物濃度，例如葡萄糖、乳酸、氨離子，這些數(shù)據(jù)能夠間接反映細(xì)胞的代謝健康狀態(tài)，又同時(shí)，他規(guī)定了針對(duì)工作細(xì)胞庫(kù)中的細(xì)胞予以定期“回檢”的制度，像每復(fù)蘇5至10支凍存管，就抽檢一支開展關(guān)鍵性能指標(biāo)的復(fù)核，以此確保庫(kù)存細(xì)胞的質(zhì)量始終處于可知可控的狀態(tài)。
經(jīng)過兩個(gè)多月，進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)整，又耐心等待，之后新的細(xì)胞庫(kù)投入了使用。李工和他的團(tuán)隊(duì)欣喜地發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線重新變得平穩(wěn)，而且有力，表達(dá)目標(biāo)抗體的效價(jià)也恢復(fù)了，并且穩(wěn)定在了預(yù)期的高水平。項(xiàng)目瓶頸得以突破，整個(gè)團(tuán)隊(duì)的士氣也跟著提振了。這次經(jīng)歷，對(duì)于李工而言，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止是解決了一個(gè)技術(shù)難題。
它更像是一回深度的認(rèn)知層面的升級(jí)，對(duì)于細(xì)胞株而言，絕不可只是純粹地把它當(dāng)作消耗性的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的材料來看待，反而需要作為存有“生命”的、處于核心地位的針對(duì)工藝的資產(chǎn)予以管理。它所擁有的穩(wěn)定性乃是構(gòu)建能夠重復(fù)、具備可靠性的研發(fā)生產(chǎn)這一過程的基石。從有關(guān)克隆篩選的策略開展設(shè)計(jì)活動(dòng)，一直到針對(duì)建庫(kù)保種形成規(guī)范性，進(jìn)而到對(duì)于日常培養(yǎng)實(shí)施全方位的監(jiān)控，每一個(gè)單個(gè)的環(huán)節(jié)抱持的嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度，都是為了全力守護(hù)這份“穩(wěn)定性”。在生物醫(yī)藥開展研發(fā)的這場(chǎng)猶如馬拉松般漫長(zhǎng)的進(jìn)程當(dāng)中，有的時(shí)候，進(jìn)展緩慢實(shí)際上反而是一種快速的體現(xiàn)，基礎(chǔ)部分恰恰就是高水準(zhǔn)的呈現(xiàn)。將源頭的水源處理得澄澈干凈之后，下游的河流才會(huì)歡暢地奔騰不息。如今，李工把這套歷經(jīng)實(shí)踐打磨的細(xì)胞株管理體系整理成了部門標(biāo)準(zhǔn)的文件，它安安靜靜處于實(shí)驗(yàn)室的文件柜當(dāng)中，并且也沉淀于每一位團(tuán)隊(duì)伙伴日常操作里，持久用于后續(xù)探索道路保駕護(hù)航。
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