ELISA試劑盒選購(gòu)指南
上周跟老張一塊兒吃飯，聽聞他傾訴了諸多苦衷。老張于一家從事生物科技的公司搞研發(fā)工作，平常主要開展蛋白表達(dá)以及檢測(cè)方面的事宜。去年他們的實(shí)驗(yàn)室承接了一個(gè)規(guī)模較大的項(xiàng)目，即要對(duì)一批血清樣本里的特定細(xì)胞因子進(jìn)行批量檢測(cè)。該項(xiàng)目時(shí)間緊迫，任務(wù)繁重，致使整個(gè)團(tuán)隊(duì)都高度緊張起來了。
如何判斷ELISA試劑盒的靈敏度
老張起初的時(shí)候還算得上樂觀，他認(rèn)為不過就是運(yùn)用 ELISA 試劑盒去進(jìn)行檢測(cè)罷了，流程他都熟悉。他們所在的那個(gè)實(shí)驗(yàn)室先前一直使用的是某一個(gè)進(jìn)口品牌，雖說價(jià)格昂貴，然而為的是圖個(gè)穩(wěn)定性。此次為了能夠控制成本，采購(gòu)人員嘗試著訂購(gòu)了一批產(chǎn)自某國(guó)產(chǎn)的新品牌的試劑盒，其價(jià)格僅僅只是進(jìn)口品牌的一半。老張也沒有過多去思考，依照標(biāo)準(zhǔn)流程便著手開展工作了。
第一批數(shù)據(jù)出來后，他瞬間傻眼了。陰性對(duì)照的OD值高高飄起，樣本的檢測(cè)信號(hào)與背景噪聲幾乎難以區(qū)分，整個(gè)數(shù)據(jù)完全沒法看。重復(fù)進(jìn)行了三次，結(jié)果依舊雜亂無章?！澳菐滋熘鴮?shí)焦頭爛額，”老張抿了一口茶，“項(xiàng)目節(jié)點(diǎn)停滯在那兒，報(bào)告無法出具，老板天天詢問，組里同事也心急如焚?！薄?/p>
在于哪里出現(xiàn)了問題呢，老張讓自己的心沉靜下來，再次對(duì)整個(gè)流程進(jìn)行了審視，操作是由他自己親自去做的，步驟并沒有錯(cuò)誤，儀器剛剛校準(zhǔn)過，同樣不存在問題，那么問題極有可能出在試劑盒自身，他往外翻找出兩個(gè)試劑盒的說明書，十分細(xì)致地進(jìn)行對(duì)比，這一對(duì)比，察覺到了關(guān)鍵的差異，那個(gè)進(jìn)口的試劑盒在說明書里清晰標(biāo)注出了最低檢測(cè)限，也就是（LOD）以及定量限，即（LOQ）的準(zhǔn)確具體數(shù)值，并且還附帶了詳盡的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為支撐，而那個(gè)國(guó)產(chǎn)試劑盒的說明書之上，關(guān)于靈敏度的描述僅僅只有幾個(gè)字，即“高靈敏度”，并沒有任何一條具體的數(shù)據(jù)。
“竟然是這樣就踩進(jìn)坑里了，”老張得出結(jié)論稱，“‘高靈敏度’著實(shí)屬于一個(gè)特別模糊的用于宣傳方面的辭藻。究竟得有多高呢？是皮克級(jí)別的還是納克級(jí)別的呀？由于沒有具體的數(shù)值予以支撐，壓根就沒辦法憑借此去判定它是不是契合你所擁有的樣本濃度范圍。” 針對(duì)他們這類需要進(jìn)行低豐度蛋白檢測(cè)的樣本而言，試劑盒具備的靈敏度是首先要予以考慮的關(guān)鍵因素。隨后，他們?cè)俣扔嗁?gòu)了那些參數(shù)清晰明確的進(jìn)口試劑盒，如此一來問題便順利解決了。
如何驗(yàn)證ELISA試劑盒的特異性
因吃了靈敏度方面的虧，老張?jiān)诤罄m(xù)的試劑盒驗(yàn)證之時(shí)格外小心謹(jǐn)慎，他們所開展的項(xiàng)目涉及到幾個(gè)具有相似結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子，存在著交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，這便引出了第二個(gè)關(guān)鍵要點(diǎn)：特異性。
不行只看說明書上所寫的“特異性高”，老張說道。他分享了個(gè)方法，在正式檢測(cè)樣本以前，他設(shè)計(jì)出了一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)。用試劑盒分別去檢測(cè)目標(biāo)蛋白，檢測(cè)可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)的同源蛋白。以及檢測(cè)跟其完全不相關(guān)的蛋白。與此同時(shí)，他還試著在反應(yīng)體系之中加入過量的潛在干擾蛋白，要看對(duì)目標(biāo)蛋白檢測(cè)信號(hào)會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響。
兩天時(shí)間，這個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)付出了，然而極有價(jià)值。借助這個(gè)驗(yàn)證，目標(biāo)蛋白被他們確認(rèn)，新批次試劑盒針對(duì)性識(shí)別功能獨(dú)特，交叉反應(yīng)率處于可接受水平（比說明書所講數(shù)值低）。工作量前期曾增加，不過此步驟為后續(xù)大批量樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠性奠定穩(wěn)固根基，假陽性或假陰性結(jié)果因交叉反應(yīng)可能出現(xiàn)的情況被避免，整個(gè)項(xiàng)目數(shù)據(jù)得到更有力經(jīng)得起考究。
ELISA試劑盒的批間差怎么看
老張以為，解決了靈敏度與特異性之后，便能夠高枕無憂了。然而，沒想到在項(xiàng)目進(jìn)入中期時(shí)，他們對(duì)同品牌同型號(hào)的試劑盒進(jìn)行了一次補(bǔ)貨。結(jié)果，新舊兩批試劑盒所做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡管擬合度都良好，可是換算得出的樣本濃度值卻出現(xiàn)了系統(tǒng)性偏差。老張回憶說，雖然偏差位于廠家所聲稱的批間差范圍之內(nèi)，然而對(duì)于我們這種項(xiàng)目而言是相當(dāng)令人頭疼的情況，因?yàn)槲覀冞@個(gè)項(xiàng)目是需要縱向比較數(shù)據(jù)的。
這次他徑直聯(lián)系了廠家的技術(shù)支撐，對(duì)方作出解釋稱，來自有不同生產(chǎn)日期的原料，以及工藝上的微小調(diào)整，都有可能致使信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)細(xì)微的改變。所以，針對(duì)那些需要長(zhǎng)時(shí)間、多次進(jìn)行檢驗(yàn)的項(xiàng)目，最佳的做法是：盡量選用同一批次的試劑盒來完成全部的實(shí)驗(yàn)。要是不得不選用不同批次，那么一定要采用相同份量的標(biāo)準(zhǔn)品以及質(zhì)控樣本開展平行檢測(cè)，進(jìn)而確定它們之間的批間一致性，并且在開展數(shù)據(jù)分析時(shí)，要進(jìn)行必要的校正操作或者注明批次方面的信息。
其后，老張他們沒得辦法，只好把早先拿舊批次檢測(cè)過的一些關(guān)鍵樣本，再用新批次重新進(jìn)行抽測(cè)，以此來統(tǒng)一基準(zhǔn)。就是這么回事，這致使他深切認(rèn)識(shí)到，試劑盒的穩(wěn)定性以及批間差，乃是確保數(shù)據(jù)能有可比性以及實(shí)驗(yàn)具備可重復(fù)性的隱形關(guān)鍵所在。
小張經(jīng)歷了一系列的“坑”后，整理出了一套屬于自己的ELISA試劑盒評(píng)估流程。首先，依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ恳嗷蚨ㄐ?？檢測(cè)范圍怎樣）以及樣本類型特點(diǎn)，篩選出幾個(gè)潛在品牌。接著，堅(jiān)決不輕易相信那些廣告語，而是深入鉆研說明書里的核心性能參數(shù)情況，也就是具體的最低檢測(cè)限、對(duì)應(yīng)的檢測(cè)范圍、回收率、精密度數(shù)據(jù)，還有交叉反應(yīng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)這些內(nèi)容。而后，于條件許可之時(shí)，運(yùn)用自身樣本或者類似基質(zhì)來開展小規(guī)模預(yù)實(shí)驗(yàn)，以此驗(yàn)證其實(shí)際呈現(xiàn)狀況。最終，針對(duì)長(zhǎng)期項(xiàng)目而言，一定要規(guī)劃好試劑盒的采購(gòu)批次，并且做好批次之間的比對(duì)記錄。
現(xiàn)今，老張所在的團(tuán)隊(duì)再度直面 ELISA 檢測(cè)之際，從容程度增添了許多。他講道，挑選正確的工具是起始的那一步，可這第一步走得穩(wěn)健了，后續(xù)的事情便會(huì)順?biāo)炱饋怼?yōu)質(zhì)的試劑盒猶如一把校準(zhǔn)妥當(dāng)?shù)某咦?，它能夠使你測(cè)量得精準(zhǔn)、安心，將精力切實(shí)聚焦于科學(xué)問題自身，而非持續(xù)地排查工具所引發(fā)的誤差。于科研以及檢測(cè)的進(jìn)程中，這般的“踏實(shí)感”，價(jià)值千金難以換取。
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