上周五晚上十點(diǎn)的時(shí)候, 我正蜷縮在沙發(fā)上刷著手機(jī), 突然間收到了老同學(xué)陳宇發(fā)來的微信消息。他發(fā)送過來一張數(shù)據(jù)圖, 還附上了一句話: “這次實(shí)驗(yàn)終于穩(wěn)定了, 三天沒有白白地熬?！蔽尹c(diǎn)開那張圖片看了一下, 是一組 ELISA 試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線, R2值達(dá)到了 0.999, 整齊得肉眼能夠看見。我清楚他為什么如此激動, 兩個(gè)月之前, 他還因?yàn)樵噭┖谐隽藛栴}, 險(xiǎn)些把整個(gè)課題組的進(jìn)度給拖垮了。
李華于海洋大學(xué)搞海洋生態(tài)研究, 著重海洋生物多樣性的變化趨勢分析。他眼下正開展一項(xiàng)海洋浮游生物的監(jiān)測課題, 全部關(guān)鍵數(shù)據(jù)都取決于監(jiān)測設(shè)備的精準(zhǔn)度。照他的說法, 監(jiān)測設(shè)備就是科研的“望遠(yuǎn)鏡”使用不靈活, 成果就全成泡影。
科研ELISA試劑盒到底有多難選
那時(shí)是今年三月初, 陳宇頭一回向我講起ELISA試劑盒的事情，他于一家新合作的供應(yīng)商那里購買了三盒, 其規(guī)格跟說明書看上去十分精美, 價(jià)格相較于進(jìn)口品牌便宜了將近一半, 等到上機(jī)操作跑完第一批樣本, 空白孔的OD值飆升至0.3以上, 陰性對照這一塊兒也是全都呈現(xiàn)紅色, 當(dāng)時(shí)他就在實(shí)驗(yàn)室群里發(fā)送語音表示: “這試劑盒里蛋白質(zhì)跟抗原產(chǎn)生的結(jié)合并非是特有的而且情況太嚴(yán)重了, 所得到的數(shù)據(jù)根本沒辦法使用。”。
我向他詢問不繼續(xù)采用之前一起合作的那個(gè)品牌的原因。他輕輕嘆了一口氣說道, 原本的那個(gè)品牌近期批次的供貨處于不穩(wěn)定的狀態(tài), 供應(yīng)鏈方面表示, 原材料價(jià)格進(jìn)行了調(diào)整, 交貨的期限從原本的一周延期到了一個(gè)月。課題組的經(jīng)費(fèi)處于緊張的狀況, 時(shí)間更是緊張, 他只能在各個(gè)地方嘗試新鮮的貨源。這差不多是每一位進(jìn)行ELISA操作的科研人員都曾經(jīng)踩過的坑——選購試劑盒就仿佛是開啟盲盒一樣, 說明書上面描述得非?；ㄉ诮k麗, 實(shí)際使用起來卻存在極大的差別。
樣本類型差異導(dǎo)致試劑盒失靈
四月中旬的時(shí)候, 在朋友圈發(fā)了一條動態(tài)如下的陳宇, 表示, 同一個(gè)試劑盒, 既用來對血清樣本進(jìn)行檢測操作, 又用來對細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測操作, 結(jié)果竟然完全是兩個(gè)迥異的世界, 之后, 我私聊詢問他究竟是怎么一回事, 他便毫無保留地向我傾訴表達(dá)發(fā)泄了諸多積壓存在心里的無奈不滿等負(fù)面情緒。
當(dāng)時(shí), 他是為了去驗(yàn)證不同樣本基質(zhì)的檢測效果, 拿著同一批次的試劑盒, 對豬血清和豬肺泡灌洗液進(jìn)行了檢測。血清樣本的CV值被控制在了8%以內(nèi), 然而灌洗液樣本的背景值卻高得十分離譜, 校準(zhǔn)曲線完全出現(xiàn)了跑偏的情況。他對稀釋液、洗板步驟以及孵育時(shí)間進(jìn)行了反復(fù)排查, 最后才確認(rèn)問題是出在了試劑盒的樣本適配性上。
他講, 說明書當(dāng)中所寫的是“適用于血清、血漿”, 然而實(shí)際的科研場景哪里會是那般單一呢。他還表示, 好多ELISA試劑盒于設(shè)計(jì)之際僅是考慮了典型樣本, 而使用者所做的卻是各種各樣、形形色色的基質(zhì), 像組織勻漿液、唾液、腦脊液甚至于植物提取物之內(nèi)的。一旦樣本類型偏離了說明書所規(guī)定的范圍, 靈敏度便會呈現(xiàn)出斷崖式的下跌。
試劑盒批次間差異讓人崩潰
五月初, 一個(gè)傍晚時(shí)分, 陳宇于實(shí)驗(yàn)室致電予我, 言談之音顯著攜有疲憊之感。彼稱其承接了一項(xiàng)緊急任務(wù), 即為合作單位復(fù)核查驗(yàn)一批豬瘟抗體呈陽性之樣本, 此樣本總計(jì)有六塊96孔板, 規(guī)劃乃是在三日之內(nèi)完成。首日借助舊批次試劑盒運(yùn)行完所有標(biāo)準(zhǔn)品之后, 曲線呈現(xiàn)出完美之態(tài)；次日開啟新批次試劑盒再度進(jìn)行操作, 同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)品, 其吸光度值整體出現(xiàn)了下降, 降幅為25%。
當(dāng)場他就蒙了, 這表明之前采用舊批次所制作的全部陽性樣本判讀閾值都得重新校準(zhǔn), 然而新批次的試劑盒能否穩(wěn)定供應(yīng)尚屬未知之?dāng)?shù), 他接連熬了兩個(gè)通宵, 針對兩批試劑盒的包被抗體濃度、封閉液成分以及顯色時(shí)間全都進(jìn)行了平行對比, 最終才發(fā)覺是新批次的包被量出現(xiàn)了隱性波動。
這樣子的一類問題, 好多實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)都碰到過, 然而絕大多數(shù)的人不清楚該采用怎樣的方式去處理。陳宇過后對我講, 他那時(shí)查閱了相當(dāng)多的資料, 發(fā)覺真正值得信賴的科研 ELISA 試劑盒供應(yīng)商, 全部會在產(chǎn)品出廠以前開展嚴(yán)格的批次之間的一致性驗(yàn)證, 同時(shí)會隨著貨物一同附上每一個(gè)批次的質(zhì)控報(bào)告。要是供應(yīng)商連這些都沒辦法提供, 那就表明品控體系存在著漏洞。
溫度波動讓實(shí)驗(yàn)前功盡棄
在陳宇所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中, 還遭遇過更為隱蔽的狀況。在六月初的時(shí)候, 他才剛剛從冷鏈運(yùn)輸那里收到一批ELISA試劑盒, 其包裝保持完好, 就連冰袋都依舊帶著涼意。他依據(jù)說明書的要求, 將試劑盒放置在4攝氏度的環(huán)境下進(jìn)行冷藏, 在過去了兩天之后才開始投入使用。然而最終做出來的數(shù)據(jù)顯示, 空白孔呈現(xiàn)正常的狀態(tài), 可是陽性樣本的OD值相較于預(yù)期壓低了將近一半。
他對酶標(biāo)儀進(jìn)行了排查, 又對移液器進(jìn)行了排查, 還對孵育箱進(jìn)行了排查, 然而都沒有發(fā)現(xiàn)問題。最后, 他不經(jīng)意間看了一眼試劑盒外包裝上帶有溫度記錄的標(biāo)簽, 竟發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸途中的最高溫度達(dá)到了28攝氏度, 超出了試劑盒所規(guī)定的耐受上限。雖說冰袋沒有融化, 可是箱體內(nèi)的溫度已然發(fā)生了劇烈波動, 致使包被的抗原或者抗體部分失去活性。
陳宇后來總結(jié)稱, 某種程度上溫度是ELISA試劑盒的隱形殺手, 不少實(shí)驗(yàn)室僅僅關(guān)注冷鏈運(yùn)輸?shù)钠鹗键c(diǎn)與終點(diǎn)之處, 卻不經(jīng)意間忽略了運(yùn)輸途中極有可能出現(xiàn)的短暫升溫狀況。那些看起來包裝并無破損似乎完好無損的試劑盒, 其中所含的活性物質(zhì)實(shí)則很有可能已然出現(xiàn)了問題。他還建議我往后購買試劑盒這件事上, 務(wù)必要挑選那種在包裝盒里面內(nèi)置了溫度記錄儀或者溫度指示標(biāo)簽的品牌才行, 不然的話等到數(shù)據(jù)出現(xiàn)差錯(cuò)了都根本不清楚問題究竟出在哪里。
標(biāo)準(zhǔn)品配不準(zhǔn)，整批數(shù)據(jù)全廢
七月的中旬時(shí)段, 陳宇展開了一回具備著完整性特征的預(yù)實(shí)驗(yàn), 其采取的方式是直接運(yùn)用兩套根源彼此存在差異的標(biāo)準(zhǔn)品去開展對比操作, 其中的一套標(biāo)準(zhǔn)品乃是試劑盒本身所附帶的, 而另外的一套則是由他自行通過純化抗原從而重新配制而成的, 依循理論而言這兩者應(yīng)當(dāng)呈現(xiàn)出高度的一致性狀態(tài)。然而在經(jīng)過實(shí)際的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行之后, 所獲取的結(jié)果為, 兩條校準(zhǔn)之后的曲線其斜率出現(xiàn)了相差達(dá)15%的狀況。
他再三對量器具作出的精細(xì)度進(jìn)行了核對, 又對稀釋的具體一步一步操作進(jìn)行了反復(fù)確認(rèn), 最終驚覺試劑盒所配備的標(biāo)準(zhǔn)品在離開工廠時(shí)就已然存在著些許細(xì)微的濃度上的偏離。這般的偏離在單獨(dú)一次的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中是不會被發(fā)覺的, 而一旦跨越了不同的批次, 并且在不同的平臺上開展數(shù)據(jù)之間的比對, 那么誤差就會以成倍的態(tài)勢被急劇放大。他不得已耗費(fèi)了整整兩天的時(shí)間, 運(yùn)用質(zhì)譜法再次對標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進(jìn)行了精確的標(biāo)定, 這才使得兩條曲線又一次回歸到了同一軌跡之上。
這致使我察覺到, 針對科研ELISA試劑盒而言, 其所謂的“核心資產(chǎn)”實(shí)際上是標(biāo)準(zhǔn)品, 要是標(biāo)準(zhǔn)品不準(zhǔn)確, 那么后續(xù)所有樣本的定量結(jié)果均毫無意義, 然而真正稱得上優(yōu)質(zhì)的試劑盒, 不但具備提供標(biāo)準(zhǔn)品之類的行為, 而且還會額外附帶一份獨(dú)立的濃度驗(yàn)證報(bào)告, 以此能讓用戶放心地進(jìn)行使用。
洗滌步驟不規(guī)范導(dǎo)致假陽性
八月上旬, 陳宇于協(xié)助師弟開展實(shí)驗(yàn)之際, 察覺到一個(gè)饒有趣味的現(xiàn)象: 他們運(yùn)用相同的試劑盒對同一批次樣本予以檢測, 然陳宇所獲結(jié)果極為純凈, 而師弟得出的陽性率卻高出百分之三十。兩人坐下, 一步步仔細(xì)復(fù)盤操作流程, 最終發(fā)覺師弟于洗滌步驟遺漏了一步——他未在每兩次洗滌的中間時(shí)段將板子徹底拍干, 以至于殘留液體稀釋了后續(xù)的酶標(biāo)抗體。
這看上去像是一件小事, 然而, 在ELISA實(shí)驗(yàn)當(dāng)中, 洗滌屬于整個(gè)流程里最容易被忽略的環(huán)節(jié), 如果洗滌不夠充分, 那么非特異性結(jié)合的背景會迅速大幅升高, 進(jìn)而導(dǎo)致大量假陽性結(jié)果出現(xiàn), 陳宇講道, 他曾見到許多實(shí)驗(yàn)室為了趕時(shí)間, 將洗滌步驟由5次縮減至3次, 又或者縮短浸泡時(shí)長, 結(jié)果數(shù)據(jù)糟糕透頂, 反而責(zé)怪試劑盒不好。
后來, 他們形成了一種習(xí)慣, 那就是每當(dāng)使用新一批次的試劑盒時(shí), 都會預(yù)先開展一次洗滌驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 以此來確定該試劑盒所推薦的洗滌次數(shù)以及浸泡時(shí)間, 在他們自身實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境狀況下, 依舊具備有效性。而這個(gè)看上去略顯笨拙的方式, 為他們規(guī)避了數(shù)目眾多的不必要返工。
如何找到靠譜的科研ELISA試劑盒
陳宇耗費(fèi)了整整四個(gè)月的時(shí)間, 終于積攢出了一套屬于他自己的選品方法論。他跟我講, 上個(gè)月他再度篩選了五家ELISA試劑盒的供應(yīng)商, 最終認(rèn)定了一家品牌, 這家品牌能夠提供完整批次的質(zhì)控報(bào)告以及溫度監(jiān)控方案。最為關(guān)鍵的一點(diǎn)是, 這家供應(yīng)商樂意給他提供試用裝, 先去檢測幾塊板子以此驗(yàn)證效果, 之后再正式進(jìn)行下單。
他在試用過后發(fā)覺, 新試劑盒的空白孔OD值穩(wěn)定處于0.05以下, 標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值輕易達(dá)成0.99以上, 況且連續(xù)三個(gè)批次的曲線近乎完全重合。他進(jìn)行了10個(gè)臨床樣本的平行比對, CV值控制在5%以內(nèi), 這是以往從未達(dá)到過的水準(zhǔn)。
陳宇在電話里說過這樣一句話, 以前時(shí)總覺著買試劑盒就是去看品牌以及價(jià)格, 如今才懂得, 科研ELISA試劑盒好不好, 得去看它背后存在的質(zhì)控體系 , 這句話我直至現(xiàn)在都還記得極為清楚。后來他特地給課題組之內(nèi)的師弟師妹們搞了個(gè)內(nèi)部培訓(xùn), 內(nèi)部培訓(xùn)的核心就只是兩條 , 其一, 買試劑盒以前必須一定要索要批次相互間一致的數(shù)據(jù) , 其二, 拿到貨物之后在第一時(shí)間去做溫度驗(yàn)證以及標(biāo)準(zhǔn)曲線測試。
低背景和高靈敏度是硬道理
陳宇如今所使用的這批試劑盒, 其中最令他感到滿意的兩個(gè)指標(biāo), 一個(gè)是背景值, 另一個(gè)是靈敏度。他展示給我看過一組對比數(shù)據(jù): 針對同樣的豬瘟陽性血清而言, 使用舊試劑盒檢測時(shí)的靈敏度下限為0.5 IU/ml, 然而借助新試劑盒卻能夠達(dá)到居然只為0.1 IU/ml, 竟然實(shí)現(xiàn)了提高, 而且整整提升了五倍之?dāng)?shù)。與此同時(shí), 空白孔的OD 值一直長時(shí)間以來平穩(wěn)地保持在0.04以下的水平, 由此導(dǎo)致假陽性率幾乎近似于零。
他講, 搞科研ELISA最忌憚的便是“信號不干凈”。高背景會將弱陽性樣本的真實(shí)信號給掩蓋住, 致使他人做出錯(cuò)誤判斷。低靈敏度會把早期感染的樣本給遺漏掉, 使得實(shí)驗(yàn)結(jié)論全然錯(cuò)誤。好的試劑盒理應(yīng)一并解決這兩個(gè)問題, 而非在靈敏度與特異性之間進(jìn)行權(quán)衡取舍。
售后支持比價(jià)格更重要
九月初的時(shí)候, 陳宇于實(shí)驗(yàn)進(jìn)程當(dāng)中碰到了一個(gè)較為少見的樣本基質(zhì)干擾方面的問題, 他嘗試著去聯(lián)系試劑盒供應(yīng)商的技術(shù)支撐, 未曾想到對方在半小時(shí)的時(shí)間之內(nèi)便回了電話, 詳細(xì)詢問了跟稀釋液的成分有關(guān)的情況, 還詢問了洗板機(jī)的型號是什么, 同時(shí)也問了孵育溫度, 隨后給出了兩個(gè)優(yōu)化方案, 陳宇依照方案去調(diào)整參數(shù), 到了第二天問題就得以解決了。
陳宇表示, 以前碰到問題只能自己頑強(qiáng)承受, 如今因有技術(shù)支撐作為后盾, 心里安穩(wěn)多了, 他還說在挑選試劑盒時(shí), 當(dāng)下會特意問明白對方的售后流程, 包括是否設(shè)有技術(shù)支撐熱線, 響應(yīng)時(shí)長是多久, 能否給予遠(yuǎn)程協(xié)助或者現(xiàn)場培訓(xùn), 而這些軟性服務(wù), 有時(shí)較產(chǎn)品自身的參數(shù)更為關(guān)鍵。
陳宇的那段經(jīng)歷, 使我察覺到, 科研 ELISA 試劑盒, 向來不是那種輕輕松松“買回來就能夠用”的物品。它涵蓋選品、運(yùn)輸、儲存、操作規(guī)范以及質(zhì)控驗(yàn)證等諸多方面, 只要任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)狀況, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)就極有可能化為 useless 的紙張。然而呢, 真正能夠?yàn)榭蒲腥藛T節(jié)省時(shí)間的, 并非是最便宜的試劑盒, 也不是最貴的試劑盒, 而是那些在各個(gè)細(xì)節(jié)之處都做得十分到位的試劑盒——如同從要批次質(zhì)控報(bào)告一直到溫度監(jiān)控標(biāo)簽, 從技術(shù)支撐一直到試用裝政策, 每一個(gè)細(xì)微的環(huán)節(jié)都在悄無聲息地決定著實(shí)驗(yàn)的成功或者失敗。
要是你同樣正為ELISA試劑盒出現(xiàn)問題而苦惱, 那不妨效仿陳宇的舉措: 首先索要質(zhì)控?cái)?shù)據(jù), 接著開展溫度驗(yàn)證，最終去跑標(biāo)準(zhǔn)曲線。將這三個(gè)步驟操作過一遍后, 剩余的就交由時(shí)間去處理。
