實(shí)驗(yàn)室用于定量檢測蛋白標(biāo)志物的常用工具是科研 ELISA 試劑盒，其數(shù)據(jù)質(zhì)量會對研究結(jié)論的可信度產(chǎn)生直接影響。不少新手在選購以及操作時容易忽視關(guān)鍵細(xì)節(jié)，進(jìn)而致使結(jié)果出現(xiàn)偏差或者重復(fù)性較差。文章依據(jù)多年實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，梳理了從選擇一直到數(shù)據(jù)判讀的核心注意事項(xiàng)，以此來幫助您避開那些常見的陷阱。
ELISA試劑盒選購
市面上銷售的 ELISA 試劑盒有好多品牌，要著重考查三個指標(biāo)，分別是檢測范圍、靈敏度以及特異性。首先要借助預(yù)實(shí)驗(yàn)或者文獻(xiàn)去確定目標(biāo)樣本里待測物的預(yù)期濃度范圍，以此保證試劑盒的檢測區(qū)間能夠涵蓋這個范圍。靈敏度可不是越高越好這般簡單，過高靈敏度有可能會使非特異性背景增加。一定要去查閱說明書里的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)，以此確認(rèn)沒有類似物產(chǎn)生干擾。
對于同一靶點(diǎn)而言，存在有不同捕獲抗體組合的試劑盒，在此情況下，建議去對比幾家的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，要關(guān)注批間差以及批內(nèi)差系數(shù)，一般來說，CV值小于10%是比較好的，還能夠向供應(yīng)商請求索取免費(fèi)小樣來進(jìn)行預(yù)測試，運(yùn)用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品去驗(yàn)證回收率，當(dāng)回收率處于80%-120%之間時，這便表明試劑盒適配您的樣本類型。
ELISA操作誤區(qū)
加樣環(huán)節(jié)經(jīng)常出現(xiàn)的失誤有這些，洗板要是不徹底，殘留的液體就會把后續(xù)的試劑給稀釋了，過度干燥又會讓板孔失去活性。建議使用多通道移液器，加樣的時候要保持垂直狀態(tài)，防止產(chǎn)生氣泡。每一步孵育的溫度以及時間都必須嚴(yán)格保持一致，先把恒溫箱預(yù)熱到37℃，然后再把板子放進(jìn)去，邊緣的孔因?yàn)闇囟炔痪鶆?，可以用封板膜給覆蓋起來。
顯現(xiàn)顏色的階段，得把控住中止良機(jī)，最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)深黃色，而空白孔保持清澈時，要馬上添加終止液，終止過早會致使低值樣本信號微弱，過晚則本底會升高，此外，不同試劑盒的終止液成分不一樣，不能混合使用，要是使用同一酶標(biāo)儀，需要定期校準(zhǔn)濾光片波長。
ELISA數(shù)據(jù)判讀
直接影響計(jì)算準(zhǔn)確性的是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方式，四參數(shù)邏輯斯蒂曲線能適用于S型數(shù)據(jù)，然而線性擬合僅僅只是適合狹窄濃度區(qū)間 ，刪除明顯偏離的異常點(diǎn)之前是需要有記錄依據(jù)的，不可以主觀進(jìn)行剔除 ，復(fù)孔間的CV值超過15%的時候應(yīng)當(dāng)復(fù)查原始OD值，要排除加樣或者洗板失誤。
計(jì)算樣本濃度之際要留意稀釋倍數(shù)校正，高濃度樣本倘若超出檢測上限就得重新進(jìn)行稀釋測定，絕不能借由外推去估算。不妨建議每個樣本設(shè)置兩個以上的稀釋梯度，以此來驗(yàn)證稀釋線性。最終的數(shù)據(jù)報告應(yīng)當(dāng)涵蓋標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、各個質(zhì)控品的實(shí)測數(shù)值，以便于他人能夠進(jìn)行復(fù)現(xiàn)。
