實(shí)驗(yàn)室用于定量檢測蛋白質(zhì)、抗體或者激素等生物分子的常用工具是ELISA試劑盒，不少新手在使用它的時候常常歷經(jīng)結(jié)果不穩(wěn)定、背景過高以及標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳這些問題，事實(shí)上，只要把控好幾個關(guān)鍵細(xì)節(jié)，檢測數(shù)據(jù)的可靠性與重復(fù)性就能得以顯著提升。
ELISA試劑盒怎么選
選 ELISA 試劑盒之際，得先弄明白檢測樣本的種屬是啥，類型又是怎樣，像血清、細(xì)胞上清或者組織勻漿這類。不同樣本所存在的基質(zhì)效應(yīng)，會對抗體識別效率產(chǎn)生影響，因而務(wù)必要去確認(rèn)試劑盒說明書里樣本的適用范圍。其次呢，要關(guān)注靈敏度以及檢測范圍，以此保證目標(biāo)濃度處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間區(qū)域。最后，得核對試劑盒里面的組分是不是齊全，預(yù)包被板、檢測抗體、標(biāo)準(zhǔn)品還有顯色液，這幾樣一個都不能少。
ELISA試劑盒操作關(guān)鍵點(diǎn)
最容易出差錯的步驟是加樣環(huán)節(jié)，標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本應(yīng)當(dāng)使用新鮮槍頭，以此避免交叉污染，孵育溫度連同時間要依循說明書嚴(yán)格操作，一般而言37攝氏度的恒溫箱相較于室溫更為穩(wěn)定，洗滌步驟決定了背景噪聲的高低，每孔洗液都得加滿。靜置30秒之后再拍干，重復(fù)5次以上，顯色反應(yīng)需留意避光，終止液加入之后要在15分鐘內(nèi)完成讀數(shù)。
ELISA試劑盒保存條件
對于未開封的試劑盒，應(yīng)當(dāng)存儲在二至八攝氏度的環(huán)境里，千萬要忌諱冷凍，這是因?yàn)橐墙?jīng)歷反復(fù)凍融的情況，就會對包被板的蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞的。要是已開封的標(biāo)準(zhǔn)品跟檢測抗體在一次使用的時候用不完，那就需要進(jìn)行分裝之后，凍存于零下二十度才行，不然多次汲取取用致使降解。工作濃度的某些洗液以及稀釋液，能夠在短期于室溫的條件下存放，不過要是超過一周的話，建議重新去進(jìn)行配制。每次在使用之前，都要去觀察試劑有沒有沉淀或者變色的現(xiàn)象，一旦發(fā)現(xiàn)異常就要立刻停止使用。
數(shù)據(jù)異常排查步驟
要是標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)比0.99低的時候，則先去查看標(biāo)準(zhǔn)品稀釋是否精準(zhǔn)恰當(dāng)，這里推薦使用那種擁有刻度的高精度移液器。當(dāng)樣本讀數(shù)超過檢測上限之際，應(yīng)當(dāng)開展梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)以此來確定最佳稀釋倍數(shù)。高背景常常是由于洗滌不夠充分或者孵育時間過長所造成起因?qū)е露傻那闆r，增加洗滌的次數(shù)或者縮短二抗孵育的時間通常往往常常往往這般常常往往往往這般常常往往這般往往常常這般往往這般往往能起到改善的作用效果。要是復(fù)孔變異系數(shù)超過15%的時候，要留意注意排除板邊緣效應(yīng)，能夠?qū)⒚笜?biāo)板用封板膜覆蓋之后進(jìn)行溫和振蕩。
