用于基因表達(dá)分析、病原體檢測等領(lǐng)域的熒光定量PCR技術(shù)，因具備高靈敏度與特異性之特性，已然成為該領(lǐng)域頗為重要的工具。作為熒光定量PCR技術(shù)核心耗材的熒光定量PCR試劑盒，其性能會對實驗結(jié)果的可靠性以及重復(fù)性施以直接影響。本文會從實際操作所涉及的角度出發(fā)，去分享選擇和使用該試劑盒的關(guān)鍵要點。
如何保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性
決定數(shù)據(jù)可信度的首要指標(biāo)乃是試劑盒的擴(kuò)增效率，在理想狀況之下，本該處于90%至110%之間以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計算而得，于使用之前建議先行測試陰性對照以及陽性對照來觀察Ct值是否處于正常范圍之中，要是陰性對照出現(xiàn)顯著擴(kuò)增曲線則可能暗示試劑或者環(huán)境存有污染從而需要重新更換耗材。
關(guān)鍵同樣在于模板質(zhì)量，所提取的核酸應(yīng)當(dāng)確保純度高，且沒有抑制劑殘留，像苯酚、乙醇這類常見的抑制劑會干擾聚合酶活性，致使Ct值偏大或者擴(kuò)增曲線出現(xiàn)異常的情況，采用試劑盒配套的ROX參比染料能夠有效校正管間差異，從而提升數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。
怎樣提高熒光定量PCR擴(kuò)增效率
對退火溫度予以優(yōu)化是最為直接的改進(jìn)方式，此方式能起到改進(jìn)的作用。不同引物對所對應(yīng)的最佳退火溫度大概會有2至5℃的差別，這種差別應(yīng)當(dāng)有所注意其存在。建議借助溫度梯度實驗去進(jìn)行篩選，篩選這個重要之舉要切實開展。試劑盒給出的說明書里一般會提供參考范圍，該參考范圍對實驗有相應(yīng)的指導(dǎo)意義。然而，當(dāng)實際樣本較為復(fù)雜的時候需要進(jìn)行微調(diào)作進(jìn)一步的調(diào)整。與此同時，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度要控制在80至150bp的范圍之內(nèi)，此范圍需精準(zhǔn)把控。過長的片段會致使擴(kuò)增效率有所降低，這種降低的情況是要加以避免的。
反應(yīng)體系的配制同樣得嚴(yán)格遵循規(guī)范，要使用帶有濾芯的移液槍頭，以此來防止氣溶膠造成污染，各組分添加完成之后要充分進(jìn)行混勻，不過得避免產(chǎn)生氣泡，因為氣泡會對熒光信號的采集形成阻礙，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差，此外，試劑盒從零下二十?dāng)z氏度取出以后應(yīng)當(dāng)徹底融化，并且要顛倒進(jìn)行混勻，絕對不要劇烈振蕩。
熒光定量PCR試劑盒靈敏度有多高
目前，主流試劑盒的檢測下限，能夠達(dá)到10至100拷貝每反應(yīng)，具體的數(shù)值，是由引物設(shè)計以及試劑配方來決定的。高靈敏度的試劑盒，一般會采用熱啟動Taq酶，還有優(yōu)化的緩沖液系統(tǒng)，這能夠抑制非特異性擴(kuò)增，進(jìn)而提升低濃度模板的檢出率。但是要注意，靈敏度并非越高就越好，過高的靈敏度，有可能增加假陽性風(fēng)險。
在實際的應(yīng)用情形當(dāng)中，建議依據(jù)目標(biāo)基因的豐度情況來挑選適宜靈敏度的產(chǎn)品。比如說在對稀有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測之際，能夠優(yōu)先去選擇宣稱靈敏度處于10拷貝以內(nèi)的試劑盒，與此同時要設(shè)置最少3個重復(fù)孔用來評估批內(nèi)所存在的變異。要是重復(fù)孔的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差大于0.3，那就表明體系的穩(wěn)定性不夠充足，需要去排查加樣或者儀器方面產(chǎn)生的問題。
試劑盒儲存條件有哪些注意事項
任何熒光進(jìn)行定量的PCR試劑盒啦在保存的時候都必須要避開光線，這是由于熒光染料或者探針一旦碰到光線就特別容易降解從而失去效用。還沒有開封的試劑應(yīng)當(dāng)放置在零下二十?dāng)z氏度的冰箱里面，要防止反復(fù)地凍融才行。反復(fù)凍融要是超過三次的話就會特別明顯地降低酶的活性以及探針的性能。建議把試劑分裝成為單次使用的較小份額兒 ，在取用之后要馬上放回到冷凍的那種環(huán)境里面。
已配制好的反應(yīng)混合液，要是當(dāng)天不使用的話，就需要在4攝氏度環(huán)境下進(jìn)行短期保存，且保存時長不能超過12小時。在運輸這個過程當(dāng)中，如果采用干冰或者冰袋的方式，那就需要確認(rèn)，收貨的時候干冰沒有完全升華。收到試劑盒之后，要先檢查每管是不是有液體泄漏的情況，并且記錄下生產(chǎn)批次號，以此方便后續(xù)出現(xiàn)問題的時候能夠進(jìn)行追溯。
