利用特異性熒光探針于擴增進程中憑借實時釋放信號以精準檢測目標序列的探針法熒光定量PCR歸屬為一種具備高靈敏度的核酸定量技術(shù)，相較于染料法而言，其能夠有效地避開非特異性干擾，適用于多重基因檢測以及低豐度樣本分析。
探針法熒光定量PCR原理是什么
該技術(shù)是以Taq曼探針的水解遵循的原理為依據(jù)的，探針的兩端各自都標記著熒光報告基團以及淬滅基團。待處在探針完整的狀況之下，熒光是會被淬滅的。在PCR退火的階段，探針會和模板實現(xiàn)結(jié)合。當延伸的時候，Taq酶所具備的外切活性會把探針切斷，報告基團會遠離淬滅基團，進而會發(fā)出可以被檢測到的熒光信號。熒光的強度跟起始模板量呈現(xiàn)出正比關(guān)系。
引物和探針如何設(shè)計
在進行引物設(shè)計之際，要將擴增片段的長度把控在70至150bp的范圍之內(nèi)，引物的Tm值需處于55至60℃之間，GC含量要維持在40%至60%的水平。探針的Tm值應(yīng)當比引物高出5至10℃，其長度為20至30bp，并且5'端不可以是G堿基，以此來防止淬滅報告基團。要運用專業(yè)軟件去檢查二級結(jié)構(gòu)，避免探針與引物形成二聚體，從而確保擴增的特異性。
實驗優(yōu)化有哪些關(guān)鍵點
鎂離子的濃度需優(yōu)化到3至5mM，要是鎂離子濃度過低，那擴增效率就會降低，倘若過高，非特異性產(chǎn)物便會增加。探針濃度一般是50至200nM，引物濃度為200至400nM。退火溫度比探針Tm值低5℃，利用梯度PCR來確定最佳溫度。添加熱啟動Taq酶以及UNG防污染系統(tǒng)，能顯著提高數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。
常見問題及解決辦法
若熒光信號呈現(xiàn)出微弱的狀況，那就去檢查一下探針是不是存在降解的情況或者淬滅基團有沒有失效，然后更換新鮮標記好的探針。倘若擴增曲線呈現(xiàn)出“S”型的異常狀態(tài)，一般是因為引物二聚體所導(dǎo)致的，那就嘗試去提高退火溫度或者重新去進行引物的設(shè)計?；€出現(xiàn)漂移大多是由模板降解而引發(fā)的，建議使用沒有RNase的耗材并且將樣本分裝保存。
