把起始模板量進行精準測定的實時熒光定量PCR，也就是qPCR，是通過對熒光信號進行實時監(jiān)測來達成的，它不需要進行電泳，其動態(tài)范圍比較寬，在基因表達做分析、轉(zhuǎn)基因檢測以及微生物展開定量這些方面被廣泛運用。若想要得到可靠的數(shù)據(jù)，在引物設(shè)計、Ct值解讀以及染料選擇諸多環(huán)節(jié)是需要下一番功夫的。
引物設(shè)計注意什么
規(guī)定引物的長度要控制在18bp至25bp之間，而其中GC的含量需要把控在40%至60%，并且3’端要避免出現(xiàn)連續(xù)的G或者C。擴增產(chǎn)生的產(chǎn)物長度處于80bp至150bp是最為適宜的，倘若過長的話則會使擴增的效率有所降低。要用Primer - BLAST或者Oligo軟估測二級結(jié)構(gòu)，以此保證不會形成發(fā)夾以及引物二聚體。
設(shè)計完成了之后，一定要去驗證其所具有的特異性，在并非模板對照的反應之中，不應該出現(xiàn)Ct值，或者出現(xiàn)的時間非常晚，熔解曲線應當是單一的尖峰，不存在雜峰，針對SYBR Green法而言，建議設(shè)計跨越外顯子邊界的引物，防止基因組DNA污染對定量結(jié)果構(gòu)成干擾。
Ct值過高怎么辦
Ct值要是超過35，一般就意味著模板量比較低，或者擴增效率不太好。首先得去檢查核酸提取的質(zhì)量，A260/A280應該處于1.8至2.0的范圍之間。在反轉(zhuǎn)錄的步驟當中，運用隨機引物和oligo(dT)混合物能夠提升覆蓋度。適度增加模板的上樣量，或者進行預擴增，這也是常用的辦法。
要排除模板問題的話，就得去評估引物效率，用標準曲線法計算，斜率處于-3.1到-3.6之間，這對應的擴增效率是90%至110%，要是效率偏低，那就優(yōu)化退火溫度，或者重新設(shè)計引物，在反應體系里添加BSA，能減輕抑制物對擴增的干擾。
SYBR Green還是TaqMan
SYBR Green法成本低廉，不需要進行合成探針的操作，適宜開展大規(guī)模基因表達差異的篩選，然而非特異擴增會致使出現(xiàn)假陽性情況，每次實驗都一定要運行熔解曲線并且要設(shè)置無反轉(zhuǎn)錄對照，對于靶基因數(shù)量眾多、預算有限的情形，這是首選的方案。
TaqMan探針法具備極高的特異性，適宜用于多重定量以及稀有序列的檢測，然而其探針設(shè)計合成的成本比較高，周期也比較長，當存在需要絕對定量或者檢測高度同源序列的情況時，推薦運用TaqMan法，要是實驗規(guī)模較小并且追求數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性，多花費成本往往是更具價值的。
