快速 PCR 擴(kuò)增試劑盒，是分子生物學(xué)實驗里常用的工具，它借助優(yōu)化酶體系以及緩沖液成分，把傳統(tǒng) PCR 的二至三小時，縮減到三十至六十分鐘。對那些需要高頻檢測或者時間緊迫的實驗室而言，這種試劑盒能夠顯著提高工作流程的效率。
快速PCR擴(kuò)增試劑盒的原理是什么
經(jīng)過改造的DNA聚合酶被用于快速PCR，這類酶具備更強(qiáng)的延伸能力以及熱穩(wěn)定性，這是快速PCR的核心所在。專用的快速緩沖液與之配合，能夠大幅縮短變性、退火和延伸這三個步驟的停留時間。通常情況下，每個循環(huán)僅僅需要10至30秒，然而普通PCR卻需要1至2分鐘。
如何保證擴(kuò)增速度同時不損失特異性
導(dǎo)致非特異性條帶出現(xiàn)的情況容易隨著擴(kuò)增速度的提高發(fā)生，所以試劑盒一般會添加特異性增強(qiáng)因子。在選擇的時候要留意產(chǎn)品說明書里的退火溫度范圍，建議先采用試劑盒所推薦的溫度梯度去開展預(yù)實驗。此外，模板質(zhì)量也能夠?qū)μ禺愋援a(chǎn)生影響，純度比較高的樣本更易于獲取干凈條帶。
使用中需要調(diào)整哪些實驗參數(shù)
雖使用快速試劑盒，引物設(shè)計卻仍需遵循常規(guī)原則，長度是十八至二十五個堿基，GC含量為百分之四十至百分之六十。循環(huán)數(shù)通常設(shè)置成三十至三十五個，延伸時間依照目標(biāo)片段長度以每kb五至十秒來計算。退火溫度能夠參考引物理論Tm值減去二至五攝氏度，然而不同品牌試劑盒或許會有特殊要求。
怎樣快速評估試劑盒的性能
有了試劑盒之后，能夠憑借標(biāo)準(zhǔn)DNA模板以及已知引物去開展測試，留意擴(kuò)增曲線的起峰時間以及熒光強(qiáng)度。與此同時進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，查看條帶是不是單一且明亮。要是結(jié)果令人滿意，接著拿自己的實際樣本做驗證。質(zhì)量好的試劑盒應(yīng)當(dāng)在不同批次之間維持穩(wěn)定，重復(fù)三次實驗的Ct值偏差不超過0.5個循環(huán)。
